- 2025-01-10 17:05:38熒光探針標記
- 熒光探針標記是一種利用熒光物質作為標記物來檢測生物分子或細胞結構的技術。熒光探針通過與目標分子結合或嵌入，在特定波長光的激發下發出熒光，從而實現對目標分子的可視化追蹤和定量分析。該技術具有高靈敏度、高特異性、非破壞性等優點，廣泛應用于生物學、醫學、環境監測等領域。通過熒光探針標記，可以深入研究生物分子的功能、相互作用及動態變化過程。
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熒光探針標記問答
- 2017-09-24 22:18:07熒光探針標記基團fam和hex的區別
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- 2022-07-22 15:27:25熒光定量PCR實驗，熒光標記怎么選？
- 熒光定量PCR技術是將常規的PCR和熒光檢測技術相結合，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，以此實現對初始模板的定量分析。熒光定量PCR技術作為當今生物學研究的重要手段之一，在基礎科學、生物技術、醫學研究、法醫學、診斷學等多方面具有廣泛的應用前景。說到熒光定量PCR技術，我們經常會問類似于“你的實驗是染料法還是探針法”，“你用的探針是什么類型”等之類的問題，這其實是對熒光標記的選擇。根據熒光標記的不同，可以將熒光定量PCR實驗分為探針法和染料法兩大類。染料法染料法利用能與DNA雙鏈結合的染料來實現，如SYBR Green I。該染料在游離狀態下呈現微弱的熒光，一旦與雙鏈DNA的雙螺旋小溝結合，其綠色熒光增強約1000倍。因此其總的熒光強度與雙鏈DNA含量成正比，利用這一關系可以反映生成的PCR產物的量（圖 1）。SYBR Green I的吸收約在497 nm，發射波長約在520 nm，與FAM熒光分子的光譜性質類似，因此在所有的熒光定量PCR設備中都是通道檢測，即“FAM/SYBR Green I”通道。▲ 圖1 染料法原理圖理論上，所有能與雙鏈DNA結合的染料都可以用于qPCR檢測，如溴化乙錠EtBr，碘化丙啶PI，吖啶橙、Cy3等。而選擇用于qPCR反應的染料通常會從信號強度、生物安全性、檢測簡便性和經濟適用性這幾個因素考慮。例如EtBr可能存在潛在的致癌性。綜合考慮下來，SYBR Green I成了比較理想的選擇。目前，使用Evagreen的實驗者也越來越多，Evagreen作為一種新型的染料，其光譜性質與SYBR Green I類似，其優勢在于：? 對PCR反應的抑制程度小。高濃度SYBR Green I會強烈抑制PCR反應，因此要控制其使用濃度，一定程度上降低了DNA檢測的靈敏度。? 與DNA結合密度高。單位長度的DNA雙鏈上Evagreen的密度更高，為飽和型染料，消除了SYBR Green I存在的“染料重分布”的缺陷，提高檢測靈敏度的同時也可用于高分辨率溶解曲線HRM。? 化學性質更穩定，適合長期保存。TaqMan 探針TaqMan 探針基本可以滿足60%以上的qPCR實驗，如常規的基因表達和拷貝數變異CNV實驗。TaqMan 熒光探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團連接在探針的5'末端，而淬滅劑則在3'末端（圖2）。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收; PCR擴增時, Tag酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成,實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。常用的熒光基團是FAM，TET，VIC，HEX。▲ 圖2 Taqman探針MGB探針對于要分辨單堿基差異的SNP實驗，采用對堿基錯配容忍度更低的MGB探針，在淬滅基團后加入了DPI3基團（圖3），從而提高了與靶標結合的親和力；而且可以對靶點堿基進行化學修飾，如PeptideNucleic Acid和Locked Nucleic Acid。▲ 圖3 MGB探針雙雜交探針Taqman探針對探針的長度有比較嚴格的要求，雙雜交探針則消除了這一“缺陷”。雙雜交探針是由兩條寡核苷酸單鏈組成，一條的3’端帶有供體熒光分子，另一條的5’端帶有受體熒光分子（圖4）。游離狀態下熒光供體會發出熒光，但當兩條單鏈都匹配到模板鏈上時，就會發生熒光共振能量轉移FRET，受體熒光分子就可以發出熒光，其熒光強度與生成的產物的量成正比。雙雜交探針的優勢有兩點：擺脫了探針長度的限制，較長的探針可以提高與模板匹配的成功率；只有上下游兩條探針都正確匹配后才能檢測到受體熒光分子發出的熒光，特異性有所提高。▲ 圖4 雙雜交探針分子信標探針游離狀態下，分子信標探針是一種莖環結構，其環狀部分的15-30個堿基可以與靶標區域相結合匹配，下端的配對區域（左右一般各5-6個堿基）則由重復的GC組成，從而將5’的熒光分子和3’的淬滅基團緊緊聚在一起，熒光發生淬滅；當退火時，分子信標探針解開環并與模板靶標雜交，這樣熒光分子和淬滅基團的物理距離就變大了，熒光淬滅的前提就打破了（圖5）。除了MGB探針，分子信標探針也非常適合用于SNP檢測。▲ 圖5 分子信標探針除了上述幾種類型的探針之外，還有嘗試將引物和探針功能相結合的技術，如Amplifluor、LUX等，在設計難度上有所提高，但使用時更簡便。各有其應用的側重點和設計上的利弊，在此不多贅述。那么在熒光定量PCR實驗中，我們應該如何進行選擇呢？在這里，給大家總結了一些兩種方法的區別，供大家參考。表1 染料法和探針法的區別
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- 2022-04-18 13:45:53Neuron：北大李毓龍課題組構建一種全新的ATP熒光探針
- 文章概述三磷酸腺苷（Adenosine 50-triphosphate，ATP）是一種廣泛存在于體內的能量存儲分子。除了參與細胞內的能量代謝功能外，越來越多的證據表明，釋放到細胞外空間的ATP可以作為一種分子信號（嘌呤能遞質），能夠結合并激活離子型P2X受體以及代謝型P2Y受體。在神經系統中，釋放的ATP參與了多中生理病理過程，包括痛覺感受、機械/化學感知信號轉導、突觸傳遞、損傷、炎癥等。對于ATP在這些生理過程中的作用，目前的研究并未完全闡明。為了進一步研究ATP的生理功能，2021年12月22日，北京大學生命科學學院李毓龍教授團隊發表在《Neuron》期刊上發表題為“A sensitive GRAB sensor for detecting extracellular ATP in vitro and in vivo”的研究論文，該項工作展示了團隊最新開發的一種可遺傳編碼的熒光分子探針——GRABATP1.0（簡稱ATP1.0；GRAB：G protein-coupled receptor activation-based sensors），該探針以P2Y受體作為ATP的結合支架，能夠對細胞外的ATP進行高靈敏度、高選擇性以及高時空分辨率的實時測量。該項工作是李毓龍教授團隊在相繼開發了乙酰膽堿、多巴胺、去甲腎上腺素、血清素和腺苷等一系列分子探針之后的后又一重要成果，對于我們深入研究并理解ATP的生理功能具有重要意義。核心觀點1、ATP1.0是一個可遺傳編碼的細胞外ATP感受器；2、ATP1.0對于細胞外ATP具有高敏感性和高時空分辨率；3、ATP1.0可用于離體以及在體ATP釋放的實時監測。研究結果分析1. ATP1.0表現出卓越的細胞外ATP檢測性能為了開發一個遺傳編碼的ATP熒光探針，研究者首先系統地篩選了能夠被ATP激活的G蛋白耦合受體（G protein-coupled receptors, GPCRs），包括人源的P2Y1、P2Y2、P2Y4、P2Y11、P2Y12和P2Y13等。以這些GPCRs作為支架，研究者將結構敏感的綠色熒光蛋白（circularly permuted enhanced GFP, cpEGFP）插入到這些受體結構中。其中hP2Y1在插入cpEGFP后表現出最佳的膜轉運和對ATP的響應性，因此隨后研究者選擇了基于hP2Y1的嵌合體ATP0.1進行進一步優化，并且最終得到了對ATP熒光響應性最 好的ATP1.0。當ATP1.0在HEK293T細胞中表達時，它能夠很好的被運輸到細胞膜上表達，并對細胞外100mM的ATP產生一個~500%的dF/F0峰值。在特異性方面，ATP1.0對細胞外ATP的反應能夠被P2Y1的拮抗劑MRS-2500阻斷。ATP1.0對其它遞質不會產生反應，包括谷氨酸、GABA、甘氨酸、多巴胺、去甲腎上腺素、血清素、組胺和乙酰膽堿等，對二磷酸腺苷（Adenosine Diphosphate, ADP）的反應與ATP類似，但是對于其它結構類似的嘌呤能分子或衍生物，如一磷酸腺苷、腺苷、二磷酸尿核苷等幾乎不產生反應。ATP1.0的反應具有快速動力學的特征，其反應平均上升時間常數約為28 ms，平均衰減時間常數約為283 ms。在熒光強度上，ATP1.0被ATP激活時的亮度達到了直接表達hP2Y1-EGFP融合蛋白熒光強度的64%，并且ATP1.0在單光子激發下的光譜與EGFP相似，激發峰在500 nm，發射峰在520 nm。在與其它細胞外ATP分子探針的比較中，ATP1.0表現出更大的動態檢測范圍、更強的熒光反應、以及更低的信噪比。接下來，研究者探討了ATP1.0在原代培養的星形膠質細胞和神經元中的表達能力以及反應性。ATP1.0能夠廣泛的表達到星形膠質細胞和神經元的細胞上，包括胞體、突起等部位。表達到星形膠質細胞和神經元上的ATP1.0對細胞外ATP均有較好的反應，其平均dF/F0峰值分別約為1000%和780%。此外，ATP誘導的熒光反應也能夠被P2Y1、受體拮抗劑MRS-2500阻斷。此外，與HEK293T中結果相似，神經元中表達的ATP1.0對ATP和ADP均有反應，但對一磷酸腺苷、腺苷、二磷酸尿核苷均無反應。更重要的是，ATP1.0在細胞表面非常穩定，在給予10mM 的ATP 兩小時后，表達ATP1.0的神經元的熒光沒有出現明顯下降。綜上所述，ATP1.0能夠適用于多種類型的細胞，對細胞外的ATP產生高靈敏度、高選擇性和高穩定性的熒光增強反應。2. ATP1.0可用于監測體外培養細胞外的ATP水平接下來，研究者測試了ATP1.0是否能夠用于檢測神經-膠質共培養細胞中內源性ATP的釋放。在大腦中，機械刺激和細胞腫脹均能誘發胞內ATP被釋放。在表達ATP1.0的細胞中，給予細胞機械刺激（利用玻璃微電極按壓某個細胞），能夠引起一個快速、局部增強的dF/F0信號，反映了ATP的釋放。為了誘導細胞腫脹，研究者將細胞浸泡在低滲溶液（130 mOsm/kg）中;在1min內，dF/F0信號顯著增加。并且在應用MRS-2500后，這兩種刺激引起的反應都被完全抑制。研究者還發現，低滲刺激誘導的ATP釋放可能不需要依賴經典的SNARE囊泡釋放機制，因為細胞表達了破傷風毒素輕鏈（tetanus toxin light chain, TeNT，可以切割突觸短肽并阻止胞外分泌過程），但是對低滲刺激誘導的反應沒有影響；而作為對照，表達TeNT阻斷了低滲刺激誘發的谷氨酸釋放。除了刺激誘發的ATP釋放外，研究者還觀察到，即使在沒有外部刺激的情況下，神經-膠質共培養細胞中也存在自發、局部、以及短暫的ATP1.0信號。在1.6mm2成像視野中，這些自發事件以1.2次/min的速率出現，其dF/F0的平均峰值約為210%。ATP自發釋放的平均上升時間約為11s，衰減時間約為43s，其釋放范圍的平均直徑約為32mm。為了確保ATP1.0信號反映了細胞外的ATP動態變化，研究者利用三磷酸腺苷雙磷酸酶（ATP的水解酶）對細胞進行處理并成像，觀察到三磷酸腺苷雙磷酸酶能夠顯著阻斷自發事件的發生。與以前的檢測手段相比，ATP1.0具備更高的靈敏度，能夠在普通條件下特異性的檢測ATP的釋放。3. ATP1.0可用于監測斑馬魚幼體中ATP的動態變化在證明了ATP1.0可用于體外ATP的檢測后，研究者接著探討了它是否可以用于監測體內（如斑馬魚中）ATP的動態變化。在斑馬魚幼體神經元中特異性地表達ATP1.0后，利用ATP局部處理會引起視頂蓋中dF/ F0信號出現強烈的瞬時增加，這些信號能夠被MRS-2500阻斷。在驗證了ATP1.0能夠對外源ATP做出反應后，研究者進一步探討了ATP1.0是否能夠用于檢測活斑馬魚內源性ATP的釋放。ATP信號在促進小膠質細胞向損傷部位遷移中發揮關鍵作用。在表達ATP1.0的斑馬魚中，研究者發現激光消融誘導視頂蓋損傷后會導致熒光增強，其反應從損傷部位向外呈放射狀傳播。損傷后11s和64s釋放ATP的范圍，其平均直徑分別為~23mm和~34mm。接下來，研究者通過在斑馬魚的視頂葉中表達ATP1.0，同時監測ATP的釋放和小膠質細胞的遷移，斑馬魚的小膠質細胞用紅色熒光蛋白DsRed標記。研究者們發現，在激光消融后，小膠質細胞沿著ATP傳播路徑逐漸遷移到損傷部位。因此，ATP1.0非常適用于活體斑馬魚幼蟲ATP監測，并且具有較高的時空分辨率。4. ATP1.0可用于監測小鼠全身炎癥引起的ATP局部釋放ATP是應對機體急慢性炎癥反應的關鍵細胞外信使，但是在全身炎癥期間ATP釋放的模式還不清楚。研究者在小鼠腹腔注射細菌脂多糖（lipopolysaccharides, LPS）誘導全身炎癥，并通過雙光子顯微鏡來觀察直接觀察視覺皮層ATP1.0的熒光反應。注射LPS 24小時后，研究者觀察到皮質內多次ATP局部釋放事件，在記錄的20min內，其發生頻率約為5 – 10次/min。在星形膠質細胞中，ATP釋放的上升時間相對較快（
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- 2022-12-14 14:26:52naica?微滴芯片數字PCR系統對韓牛分子標記物的準確評估
- 導讀韓牛（Bos taurus coreanae）是一種馴化的哺乳動物，在韓國消費市場作為食物資源，其牛肉消費量遠超其他品種，這種消費模式導致了區分韓牛和其他牛品種的分子研究的出現。不僅是牛，其他經濟動物的不同品種在市場中的經濟價值也存在較大的差異，所以準確進行種質鑒定勢在必行。在之前的一項研究中，使用傳統的PCR方法和Sanger測序驗證確定了由TE關聯缺失事件產生的韓牛特異性SV。它可以用作區分不同牛品種的分子標記（即韓牛與荷斯坦牛）。然而，PCR存在缺陷，每個樣品都有各種最終拷貝定量。為了克服傳統PCR的局限性，并準確評估先前研究中確定的韓牛特異性SV位點，檀國大學生物醫學科學系聯合畜牧研究所和檀國大學醫學院，使用naica??微滴芯片數字PCR系統對韓牛特異性SV位點進行了更為精確的檢測，并將成果《Quantitative evaluation of the molecular marker using droplet digital PCR》發表在Genomics & Informatics雜志上。轉座元件（TEs）約占?；蚪M的一半。它們可以是一個強大的物種特異性標記，在基因組進化時沒有結構變異（SV）的回歸突變。因此，作者應用naica??微滴芯片數字PCR系統對韓牛特異性SV進行準確的定量檢測。雖然樣品在韓牛群體中的等位基因頻率變化較低，但naica??微滴芯片數字PCR系統可以通過絕對定量進行高靈敏度檢測，可以做到比PCR更準確的定量。所以naica??微滴芯片數字PCR系統平臺相比于傳統PCR更適用于分子標志物的定量評價。應用亮點：? 使用naica?微滴芯片數字PCR系統對韓牛特異性SV進行準確的定量檢測。? dPCR測定在計數單分子和分析特定群體的少量拷貝時可以高精度地定量，與qPCR相比，具有更高的準確性。? 經過sanger測序，確定了naica??微滴芯片數字PCR系統檢測準確無誤，且操作和成本均低于測序。? naica??微滴芯片數字PCR系統適用于分子標志物的定量評價。實驗方法：檢測樣本信息：共提取了五個棕色韓牛DNA和五個荷斯坦DNA作為實驗樣本。檢測方法：為了更準確地檢測韓牛特異性SV，將“Del_96”位點應用于naica??微滴芯片數字PCR系統（Stilla Technologies）。進行naica??微滴芯片數字PCR系統前確認韓牛和荷斯坦牛的DNA的濃度定量。FAM引物組和FAM探針用于檢測韓牛和荷斯坦牛基因組。VIC引物組和VIC探針設計在韓牛特異性缺失（圖 1B)。因此，FAM引物組和FAM探針（陽性對照）設計在所有牛DNA中檢測。VIC引物組和VIC探針設計用于僅檢測韓牛的熒光。▲圖 1B實驗結果：FAM染料在所有?；蚪M中均被檢測到，VIC染料僅在韓牛樣品中顯示出顯著的檢測。這表明所有韓?；蚪M都包含特定的缺失序列（Del_96區域）。在韓牛樣品中檢測到VIC染料的信號平均濃度為243（copies/ μL）。雖然在荷斯坦樣品中也檢測到平均濃度0.12（copies/μL）的VIC染料信號，但這些信號相比韓?？珊雎圆挥嫛！鴑aica?微滴芯片數字PCR系統檢測韓Del_96和荷斯坦樣品之間區域的絕對拷貝數比較。濃度圖在 X 軸上指示樣品數，在 Y 軸上指示對數刻度條（拷貝/μL）。（A）在所有樣品中檢測到FAM熒光。韓牛樣品的絕對拷貝數大約是荷斯坦樣品的兩倍。（B）僅在韓牛樣品中強烈檢測到VIC熒光。最后，文章Results and Discussion給出-數字PCR適合作為驗證物種特異性標記的平臺。綜上，對于naica??微滴芯片數字PCR技術，準確定量絕對拷貝數是一個關鍵特征，相比qPCR準確性更高，naica?微滴芯片數字PCR為本文的檢測提供了有利的支持，也驗證了這一特征。在不久的將來，通過將物種識別工具應用于naica??微滴芯片數字PCR系統，它作為大樣本量物種鑒定平臺具有巨大潛力。所以naica??微滴芯片數字PCR系統適合作為驗證物種特異性標記的平臺。期刊介紹：Genomics & Informatics是由韓國基因組組織發行的涉及農業和生物科學、生物化學、遺傳學、分子生物學、健康信息學等領域的期刊。
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- 2022-04-29 12:54:04直播回顧 | 抽絲剝繭，超多重免疫標記解密腫瘤微環境之奧秘
- 4月20日上午，徠卡與轉化醫學網共同舉辦了網絡研討會——“抽絲剝繭，超多重免疫標記解密腫瘤微環境之奧秘”。徠卡生命科學部的高級應用專員劉繼紅和Cell DIVE應用科學家Michael Smith為廣大觀眾揭示了CELL DIVE 超多重標記解決方案如何輕松應對復雜的腫瘤微環境，為臨床腫瘤的研究和治 療提供了優秀的研究工具。Indica Labs應用科學家趙永田重 點介紹了在HALO中對獲取的Cell DIVE圖像的處理、分析步驟以及如何進行高緯的空間生物學分析，用以了解腫瘤微環境中腫瘤細胞和免疫細胞的相互作用關系對研究腫瘤免疫應答的作用機制。01CELL DIVE使用的抗體是開放的嗎？有大約多少種經過驗證的抗體？A：CELL DIVE 的抗體是開放的，有350種以上的抗體經過驗證的抗體可以使用。02CELL DIVE可以在臨床上用嗎，是否有注冊證？A：目前沒有注冊證，正在申請中。03這個平臺的檢測聯系哪位呢？A：可以聯系Leica公司各地的應用支持和銷售。04這個染色是儀器自動染色嗎？A：可以手動染色也可以和自動染色儀聯用自動染色。05哪個實驗室可以檢測？A：Leica公司有DEMO機，可以提供一定的演示。06成像是全片還是一個視野？A：成像儀可以選擇全片成像或者選取一個或多個視野成像。07怎樣避免非特異性染色 ？核陽性的和胞漿包膜可以隨意搭配嗎？A：首先要選擇特異性好的抗體，我們抗體庫的抗體都是經過驗證的抗體。細胞核陽性和胞漿包膜理論上可以自由搭配。08每一輪染完了，除了染料失活，是不是還需要去除一抗？A：每一輪染色成像完成，染料失活 不需要去除一抗。09CELL DIVE是不需要摸索一抗濃度的嗎，固定的protocol會不會造成有的組織染不出來有的組織卻染色過強？A：徠卡的protocol適用于絕大多數的組織，有些組織的某個marker 表達特別高或者特別低，可能需要修改抗體濃度。10抗體是什么方法學檢測標記？除了主講人介紹的熒光濾鏡，能否使用其他的熒光標記和濾鏡？A：抗體驗證時參照同樣marker的免疫組化的結果；為了減少串色的發生，我們推薦使用Cy2、Cy3、Cy5、Cy7光譜基本相同的染料標記。11成像也是設備自動化進行的嗎？A：成像時設備自動進行的，但是可以在拍照前根據樣本的染色情況進行優化。12Did you find any nonspecific staining while utilizing the different CD markers for immune cells?（Michael Smith）A：The Cell DIVE solution comes with a list of 350+ antibodies that have been validated for use with the workflow, and for specificity and sensitivity. For antibodies that are not used from the list, we provide details on a three part antibody validation process that also ensures that antibodies used are specific. In the case of residual nonspecific signal, this is likely removed by the autoflourescence imaging and removal of that signal that occurs at every round. So, in our hands, nonspecific staining is minimized at the level of antibody quality control and the image processing that the software performs.13關于細胞間鄰近距離的分析，我們如何設定所計算的距離范圍？A：關于細胞間鄰近距離的分析，所定義距離的范圍目前還沒有相應的標準。考慮到不同細胞亞型的相互作用，不同免疫細胞亞群之間鄰近距離的設定可能需要不同的標準。在分析中，HALO可以對距離進行設定，并按照不同的區間（例如0~5μm，5~10μm，10~15μm……）給出鄰近細胞的數量和密度。分析中先進行預分析，根據不同距離范圍內免疫細胞的密度和臨床信息進行相關性分析。再把確定的距離應用到所用的樣本切片中。14在分析過程中，我們可以選擇局部視野進行分析嗎？還是僅能對全組織切片進行分析？A：分析中，我們建議針對全景組織切片進行分析，但HALO也可以定義ROI區域進行選擇性的視野進行分析。這兩種分析方法在HALO里都可以實現的。
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滬公網安備 31011502008050號