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2025-04-02 11:52:34合成生物學
合成生物學是一門交叉學科，它結合生物學、工程學、計算機科學等多個領域，旨在通過設計、構建和改造生物系統，以創造新的生物功能、產品或過程。該領域的研究人員利用基因編輯、合成基因網絡等技術，模擬自然界的生物過程，甚至設計出全新的生物部件和系統。合成生物學的應用廣泛，包括生物制造、醫藥開發、環境治理等，為解決能源危機、環境污染等全球性問題提供了新思路。

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2023-04-10 15:50:43合成生物學握手AI，你想要的合成生物學
根據NCBI的ClinVar數據庫統計，包括罕見疾病，如鐮狀細胞病、地中海貧血和先天性萊伯黑朦等超過3萬7千種已知疾病與致病性單核苷酸變異（SNV）有關，SNV可能導致原始DNA序列、轉錄水平和蛋白質序列等其他特性的變化。而新一代CRISPR/Cas9技術——堿基編輯器（BEs）可以有效地修復堿基突變，而不會誘導雙鏈DNA斷裂，從而能夠直接、不可逆地校正堿基突變，對于治愈SNV引起的遺傳疾病具有十分廣闊的前景。已經報道的有誘導C·G到T·A轉化的胞嘧啶堿基編輯器（CBE）、誘導A·T到G·C轉化的腺嘌呤堿基編輯器（ABE）和使C·G到G·C轉換的糖基化酶堿基編輯器（GBE），這些BEs為治 療50%以上致病性SNV提供了幾乎理想的解決方案。然而，在實施基于BE的基因療法之前，有必要大量構建具有致病性SNV的細胞疾病模型，以用于開發和優化BEs，并使其在基因治 療中的應用成為可能。同時，根據ClinVar的數據，大約50%的人類致病性SNV是C·G到T·A的轉化，然而目前很難通過合理的人力和資金投入獲得大量攜帶這些SNV的細胞模型。這一方面是由于大規模樣品，手動操作不僅耗時，而且容易出錯，一致性較差且成本高昂；另外一方面，現有的基于目標-位點集成庫的方法，如Be-Hive等在為AI學習和預測編輯性能的數據時，缺乏原位信息的綜合編輯位點數據，同時又缺少真實染色體環境（先前研究表明，核酸酶的性能與染色質可及性之間存在很強的相關性，并且基因編輯在真核染色質中比異染色質中更有效）。中科院天津工業生物技術研究所和天津科技大學的團隊，開發了一個由以下四個模塊組成的用于哺乳動物細胞高通量原位基因編輯的自動化平臺，實現了哺乳動物細胞基因編輯的標準化和可拓展性。（1）內源性靶gRNA計算機輔助設計；（2）gRNA表達質粒構建；（3）哺乳動物細胞堿基編輯；（4）CBEs性能模型構建的機器學習。四個模塊組成的用于哺乳動物細胞高通量原位基因編輯的自動化平臺，實現了哺乳動物細胞基因編輯的標準化和可拓展性。該平臺借助大規模的原位編輯數據和序列信息，結合局部染色質可及性，具有原位數據的機器學習模型能夠更好地預測實際的堿基編輯效率，使獲得內生目標的大規模編輯數據集成為可能。圖1 全自動高通量哺乳動物基因編輯平臺概覽在這四個模塊中，第 一個模塊用于負責gRNA設計，以將人類致病性SNV引入野生型細胞，作者使用生物信息學分析選擇了1210個基因作為靶位點，使用包含每個靶位點上游3 bp至下游750 bp靶區的DNA序列，分批處理用于分析編輯結果的三對引物。對于自動化gRNA質粒構建工作流程模塊，gRNAs質粒構建過程中采用了貝克曼庫爾特Echo納升級聲波移液系統用于操縱DNA組裝反應，相對于標準的Golden Gate DNA組裝方法的反應體積為15μl，Echo的納升級和無吸頭操作能夠對實驗步驟進行一系列優化，將反應系統最小化到1微升的總體積，從而顯著降低了實驗成本。隨后使用貝克曼庫爾特Biomek i7自動化移液工作站將DH5α感受態細胞與Golden Gate產物進行混合，通過ClonePix進行轉化鋪板，并在通過DNA測序驗證構建質粒之后，使用Biomek i7進行質粒提取。為了分析數據編輯結果，使用Python腳本讀取sanger測序文件，比較N20，并創建兩個參考csv文件。錯誤的組裝csv文件包括一個選擇列表，用于從48孔細菌菌落板到96孔深孔板中挑選新菌落，以便ClonePix進行另一輪驗證。正確組裝csv文件包含N20測序及其在96孔深孔板中的位置，用于使用貝克曼庫爾特Biomek i7自動化移液工作站進行質粒提取。此模塊高通量自動化系統在4天之內共構建和分析了1210個gRNA質粒，成功率達99%，實現了每天384個gRNA組裝的通量。而后續使用Biomek i7進行的質粒提取，通量則可達到576個質粒/天。圖2 全自動gRNA質粒構建工作流程概述示意圖第三個模塊是哺乳動物細胞中的堿基編輯，如圖3。通過優化實驗條件，作者開發了使用Biomek i7自動化移液工作站進行包括細胞接種和轉染、細胞培養基更換以及進行樣品收集在內的編輯過程。隨后進行靶區域的細胞裂解和PCR擴增。全自動高通量系統在6h內將1210組gRNA和BE4max質粒共轉染到HEK293T細胞中，并在2 h內完成后續培養基更換。培養5天后，收獲編輯的細胞于8小時內完成進行PCR分析，然后進行sanger測序。使用Python腳本產生3個csv文件，一個用于準備新一輪PCR的挑選列表，以分析使用Biomek i7從96孔裂解樣品板到96孔PCR板的false sample；第二個csv文件包含用于分析false sample的第二個引物對的序列和位置信息，用于新一輪PCR；第三個csv文件包含正確的樣本和編輯效率結果，用于下一步的AI學習。圖3 自動化基因編輯過程的工作流程概述第四個模塊為作者開發的AI模型——染色質可及性學習模型（CAELM），預測基礎編輯的結果。CAELM基于自動化平臺生成的高度均勻的原位基因組編輯數據，預測HEK4T細胞中的BE293max行為，并實現了0.64的皮爾遜相關值。皮爾遜r是評估數值數據模型準確性的最普遍指標之一，CAELM模型中考慮了目標序列的真實染色體環境，這提供了更好、更現實的預測；同時，CAELM還提供了模型輸入的特征重要性得分，并揭示了DNA可及性相對于目標序列上下文的貢獻在預測中接近1:6。通過與32個不同基因組位點的手動操作進行比較，其中16個目標位點在兩個操作過程中的編輯效率幾乎相等，而自動化高通量系統在其他14個位點的統計分析中表現出更高的編輯效率。這些結果表明，自動化高通量系統能夠以與手動操作相當的效率執行基礎編輯；隨機選擇BE4max編輯靶標的1210個與疾病相關的SNV的編輯效率均達到了較高水平，說明可以同時有效地操縱數千個內源性靶位點的人類細胞的全自動高通量原位基因編輯平臺的成功建立。
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2022-11-25 17:36:55大咖共話｜合成生物學工藝探討與在線過程分析展望
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2023-02-15 14:27:47腫瘤疫苗生物學活性評估
腫瘤疫苗背景腫瘤疫苗，是一種具有預防和治 療潛力的有吸引力的替代免疫治 療選擇，是近年研究的熱點之一。針對腫瘤相關抗原（Tumor-associated antigen,TAA）或腫瘤特異性抗原 (Tumor specific antigen,TSA) 的疫苗可以特異性地攻擊和破壞抗原過表達的惡性細胞，并由于免疫記憶而實現慢性治 療反應。因此，與其他免疫療法相比，癌癥疫苗提供了特異性、安全性和可耐受的治 療。根據腫瘤抗原的組分，癌癥疫苗大致可以分為四種類型：基于 DNA 的疫苗，基于 RNA 的疫苗，基于多肽的疫苗和基于免疫細胞的疫苗。FDA 批準的首 個個性化腫瘤疫苗 PROVENGE (Sipuleucel-T) 是一種基于免疫細胞的疫苗，用于激素難治性前列腺癌的治 療。除此之外，Moderna，BioNTech 都在布局基于 mRNA 的腫瘤疫苗。圖 1 腫瘤疫苗抗原呈遞平臺示意圖腫瘤疫苗有效性評估方法生物體接種疫苗后，腫瘤抗原被帶到淋巴結，進而激活抗原特異性的 B 細胞和 T 細胞，活化的 B 細胞產生的抗體及活化的效應 T 細胞會使腫瘤內脹并誘導腫瘤細胞死亡。圖 2 腫瘤疫苗誘導的免疫反應示意圖如何有效的評估腫瘤疫苗的有效性是一個非常值得探討的問題，常用的腫瘤疫苗有效性驗證的方法，包括細胞因子檢測、CTL 活性檢測、T 細胞活化標志物檢測、抗體滴度檢測、ADCC 檢測等。1、細胞因子檢測細胞因子是由免疫細胞經過刺激而合成并分泌的小分子蛋白質，在免疫應答中起著非常重要的作用，因此可以通過細胞因子的分泌能力來反應疫苗誘導的細胞免疫的水平。常見的細胞因子有白介素 (IL) 、干擾素 (IFN)、 腫瘤壞死因子 (TNF) 等。下面比較了幾種常見的檢測方法。ELISA 是一種非常經典的細胞因子的檢測方法，例如在王曉東等人發表的關于胃癌疫苗研究的文章中，提到了用 ELISA 的方法檢測接種疫苗后小鼠骨 髓源樹突狀細胞（BMDCs）分泌細胞因子的能力，檢測方法如下：BMDCs 在含有 10ng/mL GM-CSF 和 10ng/mL IL-4 的 X-vivo 15 培養基中培養，37℃下培養 6 天，然后以每孔 5×104 細胞的密度在 96 孔板中接種。以 5μM 或 10μM 的最 終濃度加入疫苗抗原，孵育 24 小時。使用小鼠 TNF-α 和 IL-12 p70 ELISA Ready-SET-Go 試劑組定量培養上清中的 TNF-α 和 IL-12 。首先在 4℃下用捕獲抗體包被 ELISA 板過夜，然后在室溫下依次加入阻斷液、細胞培養上清和檢測抗體，孵育 1h 。 最 后加入終止液和顯色劑，用酶標儀 (BioTek) 在 450nm 處記錄 OD 值。檢測結果如下：從檢測結果可以看出，T7（TLR7 激動劑）的存在可以顯著提升 ML/MB 抗原誘導的免疫反應。圖 3 ELISA 法測定小鼠骨 髓樹突狀細胞 (BMDCs) 分泌TNF-α (a) 和 IL-12 (b) 的水平Ankita Leekha 等人發表的關于 SRAS-COV2 疫苗文章中，提到了用 ELISPOT 的方法評估細胞因子的分泌水平，可以作為參考。具體方法如下：從小鼠中分離脾細胞和肺細胞，使用小鼠 IFNγ ELISpot 基礎試劑盒和小鼠 IL4 ELISpot 基礎試劑盒 (Mabtech, VA, USA) 進行 IFNγ 和 IL4 ELISpot 檢測。在 37℃ 下，在預包被抗體的 ELISpot 板中，用抗原刺激脾細胞和肺細胞，培養 16-18 小時。第二天，洗掉細胞，加入生物素化的檢測抗體。洗板后，加入 1:30000 稀釋的 Extravidi-ALP 偶聯物，室溫孵育 1 小時。洗板后，每孔添加 70μL 顯色液，孵育 20-30min，形成斑點，然后用水清洗，干燥。使用 Cytation 7 (BioTek) 對斑點進行量化。每個點對應一個單獨的細胞因子分泌細胞。檢測結果如下：圖 4 ELIPSOT 方法檢測小鼠脾細胞和肺細胞分泌細胞因子的水平2、CTL 活性檢測疫苗誘導的細胞毒性 T 淋巴細胞 (CTL) 可以直接殺傷腫瘤細胞，起到抗腫瘤的作用，因此可以通過檢測 CTL 的殺傷效應來反應疫苗的效果。常用的檢測細殺傷效應的方法有很多，下表列舉了一些常用的方法。王曉東等人發表的文章中提到了 LDH 檢測，檢測方法如下：從接種疫苗小鼠的脾 臟中分離淋巴細胞（效應細胞）。EAC 腫瘤細胞（靶細胞）與淋巴細胞（效應細胞-靶細胞比例為 50:1）共培養 4h，使用乳酸脫氫 (LDH) 法測定細胞毒性。將培養 4h 后的培養上清加入在 ELISA 板中，室溫下加入底物溶液，孵育 30min。最 后，加入終止液終止反應，并用酶標儀 (BioTek) 在 490nm 處檢測光密度。檢測結果如下：相對于 PBS 對照組來說，T7-MB 組 CTL 細胞具有顯著的殺傷效應。圖 5 LDH 法測定 CTL 介導的 EAC 靶細胞的裂解水平3、抗體滴度及親和力檢測腫瘤疫苗除了可以誘導細胞免疫之外，也可誘導體液免疫，對此可通過對抗體滴度及親和力進行檢測來反應疫苗抗腫瘤的效果，ELISA 是一種非常經典的檢測方法。上述關于胃癌疫苗的文章中通過 ELISA 方法測定小鼠接種疫苗后血清中總 IgG 含量，具體檢測過程如下：小鼠接種疫苗后收集血液樣本，通過 3000g 離心 15 分鐘獲得血清樣本。ELISA 板預先在 4℃ 包被 BSA-MG1 過夜，然后在室溫下依次加載封閉溶液 2h，血清樣品 (1:50 稀釋) 和檢測抗體 1h。最 后，在體系中加入 p-NPP 底物 (Millipore) 和終止液，用酶標儀 (BioTek) 在 405nm 處記錄 OD 值。檢測結果如下：相對于 PBS 對照組來說，T7-MB 組抗體含量明顯上升。圖6 ELISA法測定疫苗誘導的血清抗體水平除此之外，在 Emily C. Gale 等人發表的關于 mRNA 遞送系統及輔劑研究的文章中，通過 ELISA 的方法測定了 mRNA OVA 模式疫苗誘導的 OVA 特異性抗體的絕 對含量及其親和力。具體檢測方法如下：抗體濃度：小鼠接種加強疫苗后，采集血液樣品，血清按照 1:100 000 進行稀釋。采用 anti-OVA mouse IgG1 ELISA (Cayman Chemicals) 試劑，按照試劑廠家的說明進行 ELISA 實驗。使用 Synergy H1 Microplate Reader (BioTek) 在 450nm 處記錄 OD 值。根據標準曲線計算血清抗體濃度，表示 mg/mL。抗體親和性：將 12 個梯度稀釋的血清與恒定濃度標記 HRP 的 anti-OVA 抗體 (3nM) 混合，并在 OVA 抗原包被的板中室溫孵育 2 小時，洗板后用 TMB 底物孵育，用 HCl 停止反應。測定 450nm 處的 OD 值。根據業內發現的單克隆抗體的共同親和力，假設對照抗體的 KD 為 1nM 對實驗組的 KD 值進行統計。這一假設僅影響報告的絕 對 KD 值，而不影響實驗組之間的相對差異。檢測結果如下：pIC 為雙鏈 RNA 結構模擬物，圖E中比較了可溶性的 pIC 和不同納米顆粒遞送系統誘導的絕 對抗體含量，從圖 E 中可以看出 2B 遞送系統誘導的 OVA 特異性抗體含量最 高。從F和G可以看出 2B 遞送系統相對于可溶性 pIC 來說誘導的 IgG 親和力也顯著升高。圖 7 pIC/PBAE NPs 增強體液免疫4、ADCC 檢測疫苗誘導體液免疫產生的抗體能夠捕捉目標抗原，阻斷這個靶分子的功能，也可以引導其他免疫細胞（如巨噬細胞和自然殺傷細胞）殺死表達抗原的靶細胞，在腫瘤治 療中，特別是血液腫瘤中，抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用 (ADCC) 起著關鍵作用，ADCC 常用的檢測方法包括細胞活力檢測、LDH 檢測、工程細胞株、Delfia、RTCA、細胞成像檢測等。王曉東等人發表的關于胃癌疫苗研究的文章中，提到了 LDH 方法檢測 ADCC，檢測方法如下：小鼠接種疫苗后，采集其血清樣本（1:25 稀釋），然后與 EAC 細胞（靶細胞）在 37°C 孵育 30min。使用小鼠 NK 細胞分離試劑盒從正常 BALB/c 小鼠中分離出自然殺傷 (NK) 細胞（效應細胞），與抗體標記的 EAC 細胞以效靶比 50:1 共培養 4 小時。采用 LDH 法 (Promega) 測定細胞毒性，檢測方法與之前提到的 CTL 活性檢測的方法一致。檢測結果如下：相對于 PBS 對照組來說，T7-MB 組產生的抗體具有顯著的殺傷效應。圖 8 LDH 法測定血清抗體介導的 EAC 靶細胞的裂解水平腫瘤疫苗生物學活性檢測解決方案推薦本文介紹了腫瘤疫苗活性檢測的常用方法，包括細胞因子檢測、CTL 活性檢測、抗體滴度及親和力檢測、ADCC 檢測等方法，涉及到了酶標儀、成像系統、流式、RTCA、洗板分液系統等設備。Agilent 細胞分析事業部可以從多個角度為用戶提供從樣品處理，到結果檢測再到數據分析的全面解決方案。
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2025-05-20 20:40:56GelMA合成步驟
打擾大家了，想咨詢一下GelMA合成過程使用A型明膠還是B型明膠呀？
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2022-07-11 11:15:40細胞壓縮的機械生物學套裝
● 機械生物學細胞反應   允許對受限制的細胞進行高級分子和形態分析● 精確的機械刺激   通過實時調整限制來觸發機械刺激● 標準細胞培養板   兼容35 mm培養皿和平面● 易于使用   通過即插即用方式快速進行實驗設置機械生物學套裝包含壓力控制器和細胞限制器，以更好地模擬體內細胞培養條件。Elveflow的Cobalt自動壓力泵產生穩定的壓力，而4D Cell的細胞限制器提供對培養微環境的測微控制。細胞壓縮和空間控制的結合提供了對受限空間和機械應力下細胞行為的洞察，增加了體外細胞分析的轉化價值。機械生物學研究的優勢1、控制壓力和物理空間：機械應力分析的理想選擇2、允許在不同的壓力設置之間快速切換：用于實時觀察細胞對機械刺激的反應3、穩定和無脈沖壓力：對細胞壓縮的全面和穩定控制4、非破壞性細胞分析：回收您的細胞以便進行分子分析5、瞬時啟動和停止壓力：快速觸發和釋放約束限制應用領域● 細胞限域測定● 動態細胞行為● 細胞遷移和癌癥轉移● 機械轉導● 細胞遷移可塑性● 細胞對機械應力的反應● 活細胞成像● 細胞分裂● 機械誘導的細胞修復● 細胞分裂過程中的基因組不穩定性● 傷口愈合和炎癥研究● 細胞包埋有用介紹鏈接使用微流體保護DNA免受機械應力：here 機械細胞壓縮：here機械生物學套裝包含的組件微流體的驚人優勢可應用于許多細胞和生物學灌注實驗與應用。因此，可以調整套裝內的組件以滿足您的特定需求。● 1×Cobalt自動微流體泵● 1×安全儲液罐● 3×4Dcell Confiner（PDMS吸盤）：PDMS環形模板 - 將細胞的播種區域劃定到施加限制的區域；● 12×Confinment slides（限制片）：（1）包含PDMS微結構（支柱）的10mm直徑玻璃蓋玻片；（2）限制高度從1到20μm（您可以為您的套件選擇多達3個不同的高度參數）；● 1×導管和連接件套裝● 3×PDMS環形模板 - 將細胞的播種區域劃定到施加限制的區域
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