Hieff NGS^® Ultima DNA Library Prep Kit for MGI^®是針對MGI^®高通量測序平臺定向優(yōu)化而成的新一代建庫試劑盒。作為全新的升級版本，本產(chǎn)品采用高質(zhì)量的酶學(xué)組成，簡化的操作流程，可顯著提高低質(zhì)量樣本文庫轉(zhuǎn)化率與擴增效率，具有廣泛的樣本適應(yīng)性，同時兼容FFPE、cfDNA、ChIP DNA等樣本，助力獲得優(yōu)異的測序數(shù)據(jù)。

• 適用500 pg-1 μg DNA樣本
• 兼容cfDNA、FFPE等低質(zhì)量樣本
• 高效的文庫轉(zhuǎn)化率與擴增效率
• 多樣本驗證可獲得優(yōu)異的文庫與測序數(shù)據(jù)
• 嚴格的批次性能與穩(wěn)定性質(zhì)控

產(chǎn)品組分

組分編號與名稱		13310ES96	13310ES98
13310-A	Endprep Mix	960 μL	2×960 μL
13310-B	Ligation Enhancer	4×720 μL	6×960 μL
13310-C	Fast T4 DNA Ligase	480 μL	960 μL
13310-D	2×Ultima HF Amplification Mix	4×600 μL	5×960 μL
13310-E	Primer Mix for MGI®	480 μL	960 μL

運輸與保存方法

-25~-15℃保存，有效期1年。

注意事項

一、關(guān)于操作

1. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

2. 請于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。

3. 配制各步驟反應(yīng)液時推薦使用移液器吹打混勻或輕輕振蕩，劇烈振蕩可能會造成文庫產(chǎn)出下降。

4. 為避免樣品交叉污染，推薦使用帶濾芯的槍頭，吸取不同樣品時請更換槍頭。

5. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進行各步驟反應(yīng)，使用前應(yīng)預(yù)熱PCR儀至反應(yīng)溫度附近。

6. PCR產(chǎn)物因操作不當極容易產(chǎn)生氣溶膠污染，進而影響實驗結(jié)果準確性。推薦將PCR反應(yīng)體系配制區(qū)和PCR產(chǎn)物純化檢測區(qū)進行強制性的物理隔離；使用專用的移液器等設(shè)備；并定時對各實驗區(qū)域進行清潔（使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑進行擦拭清理），以保證實驗環(huán)境的潔凈度。

7.本產(chǎn)品僅用作科研用途！

二、關(guān)于DNA片段化

1. 本試劑盒中兼容機械法及酶切法片段化的DNA。

2. 本試劑盒兼容范圍為500 pg – 1 μg Input DNA。應(yīng)盡可能使用A₂₆₀/A₂₈₀ = 1.8-2.0的高質(zhì)量Input DNA。表1中列舉了將本試劑盒應(yīng)用于常見應(yīng)用中推薦的Input DNA量。

表1  常見應(yīng)用中推薦Input DNA量

應(yīng)用	樣本類型	推薦Input DNA量
全基因組測序	復(fù)雜基因組	50 ng-1 μg
靶向捕獲測序	復(fù)雜基因組	10 ng-1 μg
全基因組測序，靶向捕獲測序	FFPE DNA	≥50 ng
全基因組測序，靶向捕獲測序	cfDNA/ctDNA	≥500 pg
全基因組測序	微生物基因組	≥1 ng
全基因組測序PCR-free測序	高質(zhì)量DNA	≥100 ng
免疫共沉淀測序	ChIP-DNA	≥500 pg
靶向測序	擴增子	≥500 pg

【注】：上表為使用高質(zhì)量DNA時推薦的Input DNA量，當Input DNA質(zhì)量較差或需要進行片段分選時，應(yīng)適當上調(diào)使用量。

3. Input DNA特指投入末端修復(fù)/dA尾添加步驟中的DNA。

4. Input DNA制備過程中帶入的高濃度金屬離子螯合劑或其他鹽，可能會影響末端修復(fù)/dA尾添加步驟反應(yīng)效率，建議DNA片段化后進行磁珠純化或分選。當使用機械法進行DNA片段化且產(chǎn)物不進行純化或長度分選而直接建庫時，請將DNA稀釋在TE Buffer中進行片段化，請勿在滅菌超純水中進行。當使用酶切法進行片段化且產(chǎn)物不進行純化或長度分選而直接建庫時，請確認Stop Buffer中不包含過量的金屬離子螯合劑。如條件不滿足，可先將片段化產(chǎn)物純化或長度分選后溶于TE buffer或滅菌超純水中（≤50 μL），再進行文庫構(gòu)建。

三、關(guān)于接頭連接（Adapter Ligation）

1.目前華大智造有2種序號的接頭：1-128和501-596。關(guān)于其使用要求，請詳見華大智造“關(guān)于Adapter使用”有關(guān)說明或咨詢本公司。此外，華大智造申明：2種接頭由于設(shè)計工藝不同，禁止混用，否則測序數(shù)據(jù)無法拆分！

2. Adapter的質(zhì)量和使用濃度直接影響連接效率及文庫產(chǎn)量。請按照表2和實際DNA投入量確實確定接頭用量，需要稀釋接頭時，請用TE buffer對接頭進行稀釋。

Input DNA	10μM Adapter稀釋倍數(shù)	稀釋后投入量（μL）
31ng-1 μg	不稀釋	5
11-30 ng	5	5
3-10 ng	10	5
0.5-2 ng	20	5

表2  500pg-1 μg Input DNA推薦的Adapter使用量

四、關(guān)于磁珠純化與分選（Bead-based Clean Up and Size Selection）

1. DNA片段長度分選步驟可選擇在末端修復(fù)/dA尾添加之前，或接頭連接后，或文庫擴增后進行。

2. 當Input DNA質(zhì)量≥50 ng，您可選擇在接頭連接后分選；如Input DNA質(zhì)量<50 ng，建議您在文庫擴增后進行分選。

3. Ligation Enhancer中包含高濃度的PEG，會對雙輪磁珠分選產(chǎn)生顯著影響。因此，如在接頭連接后進行長度分選，必須先進行純化步驟，再進行雙輪分選步驟；如在末端修復(fù)/dA尾添加之前或文庫擴增后進行長度分選，可直接進行雙輪磁珠分選步驟。

4. 磁珠使用前應(yīng)先平衡至室溫，否則會導(dǎo)致得率下降、分選效果不佳。

5. 磁珠每次使用前都應(yīng)充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。

6. 轉(zhuǎn)移上清時，請勿吸取磁珠，即使微量殘留都將影響后續(xù)文庫質(zhì)量。

7. 磁珠漂洗使用的80%乙醇應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率。

8. 進行長度分選時，初始樣品體積應(yīng)盡量≥100 μL，不足時請用超純水補齊。以防因樣品體積太小導(dǎo)致移液誤差增大。

9. 產(chǎn)物洗脫前應(yīng)將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇殘留影響后續(xù)反應(yīng)；過分干燥又會導(dǎo)致磁珠開裂進而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥。

10. DNA純化或長度分選產(chǎn)物如需保存，可使用TE Buffer洗脫，產(chǎn)物可于4°C可保存1-2周，-20°C可保存1個月。

五、關(guān)于文庫擴增（Library Amplification）

1. 是否需要進行文庫擴增取決于Input DNA量、應(yīng)用需要等因素。當Input DNA<200 ng時，推薦進行文庫擴增；當Input DNA≥200 ng或者不需要進行文庫擴增時，可不進行文庫擴增。

2. 文庫擴增步驟需要嚴格控制擴增循環(huán)數(shù)。循環(huán)數(shù)不足，將導(dǎo)致文庫產(chǎn)量低；循環(huán)數(shù)過多，又將導(dǎo)致文庫偏好性增加、重復(fù)度增加、嵌合產(chǎn)物增加、擴增突變積累等多種不良后果。表3列舉了本試劑盒，獲得100 ng或1000 ng文庫的所需循環(huán)數(shù)。

表3  500 pg-1 μg Input DNA獲得100 ng或1000 ng產(chǎn)物擴增循環(huán)數(shù)推薦表

Input DNA ( Into End Preparation )	Number of cycles required to generate
	100 ng	1000 ng
1 μg	0	3 - 4
500 ng	0	4 - 5
250 ng	1 - 4	5 - 7
100 ng	2 - 5	6 - 8
50 ng	4 - 7	8- 10
10 ng	6 - 8	9 - 12
5 ng	7 - 10	11 - 14
1 ng	9 - 11	12 - 15
500 pg	11 - 13	14 - 16

【注】：建庫過程中進行過長度分選時參照較高循環(huán)數(shù)擴增。

六、關(guān)于文庫質(zhì)檢（Library Quality Analysis）

1. 通常情況下，構(gòu)建好的文庫可通過長度分布檢測和濃度檢測來進行質(zhì)量評價。

2. 文庫濃度檢測可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit^®、PicoGreen^®等；基于qPCR絕對定量的方法。

3. 文庫濃度檢測不可使用：基于光譜檢測的方法，如NanoDrop^®等。

4. 推薦使用qPCR方法進行文庫濃度檢測：Qubit^®、PicoGreen^®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測定方法時，無法有效區(qū)分單端連接Adapter的產(chǎn)物、兩端均未連接Adapter的產(chǎn)物以及其他不完整雙鏈結(jié)構(gòu)產(chǎn)物；qPCR絕對定量基于PCR擴增原理，僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫（即可測序的文庫），可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測序文庫的干擾。

5. 文庫長度分布檢測，可通過Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細管電泳或微控流原理的設(shè)備進行檢測。

使用方法

一、自備材料

1. 純化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS^® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效產(chǎn)品。

2. DNA質(zhì)控：Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效產(chǎn)品。

3. DNA Adapter：詳情請咨詢?nèi)A大智造或本公司。

4. 其他材料：無水乙醇、滅菌超純水、TE Buffer（10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA）、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR儀等。

二、操作流程

 

圖1  Ultima DNA建庫試劑盒操作流程

三、操作步驟

3.1 末端修復(fù)/dA尾添加（End Preparation/dA-Taling）

該步驟將Input DNA末端補平，并進行5’端磷酸化和3’端加dA尾。

1. 將表4中各試劑解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于無菌PCR管中配制表4所示反應(yīng)體系。

表4  末端修復(fù)/dA尾添加PCR反應(yīng)體系

名稱	體積（μL）
Fragmented DNA	x
Endprep Mix	10
ddH2O	Up to 60 μL

3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液離心至管底。

4. 將上述PCR管置于PCR儀，設(shè)置表5所示反應(yīng)程序，進行末端修復(fù)/dA尾添加反應(yīng)。

表5  末端修復(fù)/dA尾添加PCR反應(yīng)程序

溫度	時間
熱蓋105°C	On
30°C	20 min
72°C	20 min
4°C	Hold

3.2 接頭連接（Adapter Ligation）

該步驟將3.1步驟的產(chǎn)物末端，連接特定的MGI^®接頭。

1. 根據(jù)Input DNA量按表2稀釋Adapter至合適濃度。

2. 將表6中各試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

3. 于3.1步驟PCR管中配制表6所示反應(yīng)體系。

表6  Adapter Ligation PCR體系

名稱	體積（μL）
dA-tailed DNA（3.1步驟產(chǎn)物）	60
Ligation Enhancer	30*
Fast T4 DNA Ligase	5
DNA Adapter	5

【注】：*Ligation Enhancer比較粘稠，請上下顛倒、振蕩，充分混勻并瞬時后離心使用。

4. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。

5. 將PCR管置于PCR儀中，設(shè)置表7所示反應(yīng)程序，進行接頭連接反應(yīng)：

表7  Adapter Ligation PCR反應(yīng)程序

溫度	時間
熱蓋105°C	Off
20°C	15 min
4°C	Hold

【注】：當Input DNA量較低，實驗效果不理想時，可嘗試將連接時間延長一倍。

3.3 連接產(chǎn)物磁珠純化（Post Ligation Clean Up）

該步驟使用磁珠對3.2步驟的產(chǎn)物進行純化或分選。純化可除去未連接的Adapter或Adapter Dimer等無效產(chǎn)物。

3.3.1 純化操作步驟：

1. 準備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取80 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.8×，Beads:DNA=0.8:1）至Adapter Ligation產(chǎn)物中，渦旋混勻或移液器吹打10次混勻，室溫孵育5 min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重復(fù)步驟5，總計漂洗兩次。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過5 min）。

8. 將PCR管從磁力架中取出，進行洗脫：

1）如產(chǎn)物無需進行片段分選，直接加入21 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。【注：如純化產(chǎn)物如需保存，可使用TE Buffer洗脫】。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約5 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，切勿觸碰磁珠。

2）如產(chǎn)物需進行雙輪分選，加入102 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。【注：如純化產(chǎn)物如需保存，可使用TE Buffer洗脫】。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約5 min），小心移取100 μL上清至新PCR管中，切勿觸碰磁珠。

3.3.2 雙輪分選操作步驟：

1. 準備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡約30 min。配制80%乙醇。

2. 請渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證混勻。

3. 根據(jù)DNA片段長度要求，參考表8向上述100 μL DNA上清中加入第一輪分選磁珠，渦旋混勻或移液器吹打10次混勻。

表8  磁珠文庫分選推薦比例

DNA文庫插入片段大小	150 - 250 bp	200-300 bp	300-400 bp
DNA文庫大小	230 - 330 bp	280-380bp	380-480bp
第一輪體積比（Beads:DNA）	0.78×	0.68×	0.58×
第二輪體積比（Beads:DNA）	0.20×	0.20×	0.20×

【注】：表中“×”表示樣品DNA體積。如文庫插入片段長度為200 bp，樣品DNA體積為100 μL，則第一輪分選磁珠使用體積為0.78×100 μL=78 μL；第二輪分選磁珠使用體積為0.20×100 μL=20 μL；表中所推薦比例是針對于Adapter Ligated Insert DNA（Post Ligation），如果用戶在接頭連接前進行分選，請采用Hieff NGS^® DNA Selection Beads（Cat#12601）說明書中推薦的比例。

4. 室溫孵育5 min。

5. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心轉(zhuǎn)移上清到干凈的離心管中。

6. 參考表8向上清中加入第二輪分選磁珠。

7. 渦旋混勻或移液器吹打10次混勻，室溫靜置5 min。

8. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

9. 保持PCR管始終處于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec，小心移除上清。

10. 重復(fù)步驟9。

11. 保持PCR管始終處于磁力架中，開蓋干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（約5 min）。

12. 將PCR管從磁力架中取出，加入適量21 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻，室溫靜置5 min。

13. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后（約5 min），小心轉(zhuǎn)移20 μL上清至干凈的管中。

3.4 文庫擴增（Library Amplification）

該步驟將對純化或長度分選后的接頭連接產(chǎn)物進行PCR擴增富集。

1. 將表9中試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于無菌PCR管中配制表9所示反應(yīng)體系。

表9  PCR擴增反應(yīng)體系

名稱	體積（μL）
2×Ultima HF Amplification Mix	25
Primer Mix for MGI®	5
Adapter Ligated DNA（3.3步驟產(chǎn)物）	20

3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。

4. 將PCR管置于PCR儀中，設(shè)置表10所示反應(yīng)程序，進行PCR擴增。

表10  PCR擴增反應(yīng)程序

溫度	時間	循環(huán)數(shù)
98°C	1 min	1
98°C	10 sec	參照注意事項中表3
60°C	30 sec
72°C	30 sec
72°C	5 min	1
4°C	Hold	-

3.5 擴增產(chǎn)物磁珠純化或分選（Post Amplification Clean Up/Size Selection）

同3.3.1步驟中純化操作步驟。使用Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）純化文庫擴增產(chǎn)物。

如需分選，操作方法同3.3.2雙輪分選步驟（純化步驟可省略）。

3.6 文庫質(zhì)量控制

通常情況下，構(gòu)建好的文庫可通過濃度檢測和長度分布檢測來進行質(zhì)量評價，具體請參見注意事項六。

3.7 文庫環(huán)化

使用Hieff NGS^® Fast-Pace DNA Cyclization Kit for MGI^®（Cat#13341）或其他等效產(chǎn)品進行文庫單鏈環(huán)化反應(yīng)。

3.8 參考實例

使用Hieff NGS^® Ultima DNA Library Prep Kit for MGI^®對 50 ng E.coli超聲樣本建庫，結(jié)果使用Agilent Bioanalyzer 2100進行檢測。

圖2  Ultima DNA建庫試劑盒樣本及PCR純化產(chǎn)物（分選前后）Agilent 2100 檢測結(jié)果