產(chǎn)品描述

 

Hieff NGS^® OnePot Pro PCR-Free DNA Library Prep Kit for Illumina^®是針對Illumina^®高通量測序平臺專業(yè)開發(fā)設計的新一代酶切法建庫試劑盒。與傳統(tǒng)的建庫法比較，本品采用高質量的片段化酶，擺脫了繁瑣的超聲過程，同時簡化了操作流程，將片段化模塊與末端修復模塊合二為一，極大的降低了建庫的時間和成本。本試劑盒具有優(yōu)秀的文庫轉化率，可應用于常規(guī)動植物基因組、微生物基因組等樣本，同時能兼容FFPE DNA樣本的建庫。改進版試劑盒使用了優(yōu)化的連接酶，極大的改善了接頭連接時的片段自連現(xiàn)象。
適用500 pg - 1 μg的基因組DNA、全長cDNA等樣本
高質量片段化酶，可隨機切割雙鏈DNA，酶切片段無偏好性
片段化、末端修復/加A一步完成
適用于FFPE DNA樣本
嚴格的批次性能與穩(wěn)定性質控

 

產(chǎn)品組分

 

組分編號與名稱			12209ES08	12209ES24	12209ES96
12209-A		Smearase® Buffer	80 μL	240 μL	960 μL
12209-B		Smearase® Enzyme	40 μL	120 μL	480 μL
12209-C		Ligation Enhancer	240 μL	720 μL	3×960 μL
12209-D		Novel T4 DNA Ligase	40 μL	120 μL	480 μL

運輸與保存方法
 

冰袋運輸。所有組分-20°C保存，有效期1年。

 

注意事項

 

一、關于操作

1. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

2. 請于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。

3. 配制各步驟反應液時推薦使用移液器吹打混勻或輕輕振蕩，劇烈振蕩可能會造成文庫產(chǎn)出下降。

4. 為避免樣品交叉污染，推薦使用帶濾芯的槍頭，吸取不同樣品時請更換槍頭。

5. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進行各步驟反應，使用前應預熱PCR儀至反應溫度附近。

6. PCR產(chǎn)物因操作不當極容易產(chǎn)生氣溶膠污染，進而影響實驗結果準確性。推薦將PCR反應體系配制區(qū)和PCR產(chǎn)物純化檢測區(qū)進行強制性的物理隔離；使用專用的移液器等設備；并定時對各實驗區(qū)域進行清潔（使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑進行擦拭清理），以保證實驗環(huán)境的潔凈度。
7.本產(chǎn)品僅作科研用途！
 

二、關于DNA片段化

1. 本試劑盒兼容范圍為500 pg - 1 μg Input DNA。應盡可能使用A₂₆₀/A₂₈₀ = 1.8-2.0的高質量Input DNA。

2. 若Input DNA中引入高濃度金屬離子螯合劑或其他鹽，可能會影響后續(xù)實驗，建議將DNA稀釋在TE（10 mM Tris-HCl ,1 mM EDTA，pH 8.0）中進行片段化。

3. 對于常規(guī)的高質量基因組DNA，酶切時間參考表4，本試劑盒片段化偏好低，耐受各種GC含量的模板。對于不同降解程度的FFPE樣本，酶切時間參考表5。以上為推薦時間，需客戶在自己的實驗體系中進行微調(diào)，以達到最佳效果。

4.為保證優(yōu)質精確的片段化效果，片段化反應配制過程請于冰上操作。

5. 針對FFPE DNA建庫，若樣本質量不佳，客戶對當前建庫產(chǎn)量不滿意，可選購我公司的FFPE DNA Repair Reagent (Cat#12606)對FFPE DNA進行修復，具體使用方法可參考此產(chǎn)品說明書。該試劑可與片段化末修加A過程同時進行，無需額外的操作。
 

三、關于接頭連接（Adapter Ligation）

1. 針對Illumina^®測序平臺，Yeasen提供48種Barcoded Adapters: Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®, Set 1~Set 4（Cat#12615~Cat#12618）；單端 96種 Index Primers: Hieff NGS^® 96 Single Index Primers Kit for Illumina^® , Set 1~Set 2 （Cat#12611~Cat#12612）；雙端384 種UDI Primers: Hieff NGS^® Stubby UDI Primer Kit for Illumina^®（Cat#12404~Cat#12407）。

2. Adapter的質量和使用濃度直接影響連接效率及文庫產(chǎn)量。Adapter用量過高可能會產(chǎn)生較多Adapter Dimer；用量較低可能會影響連接效率及文庫產(chǎn)量。表1列舉了使用本試劑盒，不同Input DNA量推薦的Adapter使用量。

表1  500 pg-1 μg Input DNA推薦的Adapter使用濃度

Input DNA	Adapter : Input DNA摩爾比	Input DNA	Adapter : Input DNA摩爾比
1 μg	10:1	50 ng	100:1
500 ng	20:1	25 ng	200:1
250 ng	40:1	1 ng	200:1
100 ng	100:1	500 pg	400:1

【注】：Input DNA摩爾數(shù)（pmol）≈ Input DNA質量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均長度（bp）]。

四、關于磁珠純化與分選（Bead-based Clean Up and Size Selection）

1. DNA片段長度分選步驟可選擇在末端修復/dA尾添加之前，或接頭連接后，或文庫擴增后進行。

2. 當Input DNA質量≥50 ng，您可選擇在接頭連接后分選；如Input DNA質量<50 ng，建議您在文庫擴增后進行分選。

3. Ligation Enhancer中包含高濃度的PEG，會對雙輪分選產(chǎn)生顯著影響。因此，如在接頭連接后進行長度分選，必須先進行純化步驟，再進行雙輪分選步驟；如在末端修復/dA尾添加之前或文庫擴增后進行長度分選，可直接進行雙輪磁珠分選步驟。

4. 磁珠使用前應先平衡至室溫，否則會導致得率下降、分選效果不佳。

5. 磁珠每次使用前都應充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。

6. 轉移上清時，請勿吸取磁珠，即使微量殘留都將影響后續(xù)文庫質量。

7. 磁珠漂洗使用的80%乙醇應現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率。

8. 進行長度分選時，初始樣品體積應盡量≥100 μL，不足時請用超純水補齊。以防因樣品體積太小導致移液誤差增大。

9. 產(chǎn)物洗脫前應將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇殘留影響后續(xù)反應；過分干燥又會導致磁珠開裂進而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥。

10. DNA純化或長度分選產(chǎn)物如需保存，可使用TE Buffer洗脫，產(chǎn)物可于4°C可保存1-2周，-20°C可保存1個月。
 

六、關于文庫質檢（Library Quality Analysis）

1. 通常情況下，構建好的文庫可通過長度分布檢測和濃度檢測來進行質量評價。

2. 文庫濃度檢測可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit^®、PicoGreen^®等；基于qPCR絕對定量的方法。

3. 文庫濃度檢測不可使用：基于光譜檢測的方法，如NanoDrop^®等。

4. 推薦使用qPCR方法進行文庫濃度檢測：Qubit^®、PicoGreen^®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測定方法時，無法有效區(qū)分單端連接Adapter的產(chǎn)物、兩端均未連接Adapter的產(chǎn)物以及其他不完整雙鏈結構產(chǎn)物；qPCR絕對定量基于PCR擴增原理，僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫（即可測序的文庫），可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測序文庫干擾。

5. 文庫長度分布檢測，可通過Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細管電泳或微控流原理的設備進行檢測。

 

使用方法

 

一、自備材料

1. 純化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS^® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效產(chǎn)品。

2. DNA質控：Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效產(chǎn)品。

3. DNA Adapter：Yeasen提供48種Barcoded Adapters: Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®, Set 1~Set 4（Cat#12615~Cat#12618）；單端 96種 Index Primers: Hieff NGS^® 96 Single Index Primers Kit for Illumina^® , Set 1~Set 2 （Cat#12611~Cat#12612）；雙端384 種UDI Primers: Hieff NGS^® Stubby UDI Primer Kit for Illumina^®（Cat#12404~Cat#12407）。或其他等效產(chǎn)品。

4. 其他材料：無水乙醇、滅菌超純水、TE Buffer（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA ，pH 8.0）、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR儀等。
 

二、操作流程

圖1.OnePot Pro PCR-Free DNA建庫試劑盒操作流程

三、操作步驟

3.1 DNA片段化/末端修復/dA尾添加（DNA Fragment/End Preparation/dA-Tailing）

該步驟將基因組DNA片段化，同時進行末端修復及dA尾添加。

1. 將表2中各試劑解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于冰上配制表2反應體系。

表2.DNA片段化/末端修復/dA尾添加 PCR反應體系

名稱	體積（μL）
Input DNA	x
Smearase® Buffer	10
Smearase® Enzyme	5
TE	Up to 60

3. 使用移液器輕輕吹打或低速振蕩混勻，并短暫離心將反應液離心至管底。

4. 將上述PCR管置于PCR儀，設置表3所示反應程序，進行DNA片段化，末端修復及dA尾添加反應。

表3  DNA片段化/末端修復/dA尾添加 PCR反應程序

溫度	時間
熱蓋105°C	On
4 °C	1 min*
30 °C	3-20 min**
65 °C	20 min
4 °C	Hold

 

【注】：*DNA片段化過程為有效控制片段化效果，避免過度酶切，反應程序可預先設置4°C，待模塊溫度降至4°C時，將PCR管放入PCR儀即可。**對于完整的基因組DNA，酶切時間參考表4，Input DNA 500-1000 ng，可根據(jù)需求，適當延長酶切時間2-4 min左右；對于質量不一的FFPE DNA樣本，酶切時間參考表5。

 

 

表4.常規(guī)基因組DNA片段化時間選擇表表

插入片段主峰大小	片段化時間	優(yōu)化范圍
600 bp	8 min	6-12 min
350 bp	10 min	8-14 min
250 bp	12 min	10-15 min
200 bp	15 min	13-18 min
150 bp	20 min	15-25 min

表5.FFPE DNA片段化時間選擇表

插入片段主峰大小	片段化時間	DIN*
250 bp	9-13 min	> 8.0
250 bp	8-11 min	6.5-8.0
250 bp	4-8 min	4.2-6.5
250 bp	3-6 min	2.5-4.2

【注】：*DIN為DNA Integrity Number，是用Agilent 2200來定義FFPE DNA降解程度的一種方法，詳見圖2。
 

圖2.Agilent 2200定義不同降解程度樣本的DIN值

3.2 接頭連接（Adapter Ligation）

該步驟將3.1步驟的產(chǎn)物末端，連接特定的Illumina^®接頭。

1. 根據(jù)Input DNA量按表1稀釋Adapter至合適濃度。

2. 將表6中各試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。

3. 于3.1步驟PCR管中配制表6所示反應體系。

表6.Adapter Ligation PCR體系

名稱	體積（μL）
dA-tailed DNA（3.1步驟產(chǎn)物）	60
Ligation Enhancer	30*
DNA Adapter	5**
Novel T4 DNA Ligase	5

【注】：*Ligation Enhancer比較粘稠，請上下顛倒、振蕩，充分混勻并瞬時離心后使用。

**本公司接頭濃度與常規(guī)商業(yè)化試劑盒一致，皆為15 μM。
 

【接頭添加計算舉例】：當Input DNA為100 ng，Input DNA長度為300 bp時，接頭應該添加多少？

第一步：計算Input DNA摩爾數(shù)。公式：Input DNA摩爾數(shù)（pmol）≈ Input DNA質量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均長度（bp）]；

Input DNA摩爾數(shù)（pmol）=100÷（0.66×300）=0.5 pmol；

第二步：計算接頭添加摩爾數(shù)。根據(jù)注意事項三表1查詢接頭添加比例；

根據(jù)表1，查得Input DNA 100 ng時接頭添加比例100:1，則接頭添加摩爾數(shù)=100×0.5 pmol=50 pmol；

第三步：計算接頭添加體積。接頭濃度=15 μmol/L（如使用其他接頭，濃度需要依據(jù)其他接頭濃度參數(shù)）；

接頭添加體積=接頭添加摩爾數(shù)（50 pmol）÷接頭濃度（15 μmol/L）=3.34 μL（注：15 μmol/L=15 pmol/μL）

綜上，接頭可添加3.4 μL，加1.6 μL水補齊至5 μL。（注：接頭最大加入體積不超過5 μL）。
 

4. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應液收集至管底。

5. 將PCR管置于PCR儀中，設置表7所示反應程序，進行接頭連接反應。

表7.Adapter Ligation PCR反應程序

溫度	時間
熱蓋105°C	Off
20°C	15 min
4°C	Hold

【注】：當Input DNA量較低，實驗效果不理想時，可嘗試將連接時間延長一倍。
 

3.3 連接產(chǎn)物磁珠純化（Post Ligation Clean Up）

該步驟使用磁珠對3.2步驟的產(chǎn)物進行純化或分選。純化可除去未連接的Adapter或Adapter Dimer等無效產(chǎn)物。

3.3.1 純化操作步驟：

1. 準備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取60 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.6×，Beads:DNA=0.6:1）至Adapter Ligation產(chǎn)物中，室溫孵育5 min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重復步驟5，總計漂洗兩次。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過5 min）。

8. 將PCR管從磁力架中取出，進行洗脫：

1）如產(chǎn)物無需進行片段分選，直接加入21 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。【注：如純化產(chǎn)物如需保存，可使用TE Buffer洗脫】。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約5 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，切勿觸碰磁珠。

2）如產(chǎn)物需進行雙輪分選，加入102 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。【注：如純化產(chǎn)物如需保存，可使用TE Buffer洗脫】。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約5 min），小心移取100 μL上清至新PCR管中，切勿觸碰磁珠。
 

3.3.2 雙輪分選操作步驟：

1. 準備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡約30 min。配制80%乙醇。

2. 請渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證混勻。

3. 根據(jù)DNA片段長度要求，參考表8向上述100 μL DNA上清中加入第一輪分選磁珠，渦旋混勻或移液器吹打10次混勻。

表8.磁珠文庫分選推薦比例

DNA文庫插入片段大小	150-250   bp	200-300   bp	300-400   bp	400-500   bp	500-600   bp
DNA文庫大小	250-350   bp	350-450   bp	450-550   bp	550-650   bp	650-750   bp
第一輪體積比（Beads:DNA）	0.80×	0.70×	0.60×	0.55×	0.50×
第二輪體積比（Beads:DNA）	0.20×	0.20×	0.20×	0.15×	0.15×

 

【注】：表中“×”表示樣品DNA體積。如文庫插入片段長度為250 bp，樣品DNA體積為100 μL，則第一輪分選磁珠使用體積為0.70×100 μL=70 μL；第二輪分選磁珠使用體積為0.20×100 μL=20 μL；表中所推薦比例是針對于Adapter Ligated Insert DNA（Post Ligation），如果用戶在接頭連接前進行分選，請采用Hieff NGS® DNA Selection Beads（Cat#12601）說明書中推薦的比例。
 

4. 室溫孵育5 min。

5. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心轉移上清到干凈的離心管中。

6. 參考表8向上清中加入第二輪分選磁珠。

7. 渦旋混勻或移液器吹打10次混勻，室溫靜置5 min。

8. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。

9. 保持PCR管始終處于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec，小心移除上清。

10. 重復步驟9。

11. 保持PCR管始終處于磁力架中，開蓋干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（約5 min）。

12. 將PCR管從磁力架中取出，加入適量21 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻，室溫靜置5 min。

13. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后（約5 min），小心轉移20 μL上清至干凈的管中。

3.4 文庫質量控制

通常情況下，構建好的文庫可通過濃度檢測和長度分布檢測來進行質量評價，具體請參見注意事項六。

3.5 參考實例

使用Hieff NGS^® OnePot Pro PCR-Free DNA Library Prep Kit for Illumina^®對200 ng Human gDNA (NA12878) 樣本進行酶切建庫檢測，片段化結果見圖3。

圖3.OnePot Pro PCR Free DNA建庫試劑盒酶切200 ng Human gDNA樣本（不同酶切時間片段化效果檢測）

 

 

HB210203